(2)掌握制備細(xì)胞色素C的操作技術(shù)及含量的測定方法

    二、實驗原理

    細(xì)胞色素是一類含有鐵啉基團的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細(xì)胞中。細(xì)胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細(xì)胞色C (cytochrome c) 是細(xì)胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細(xì)胞色素B 和細(xì)胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一個重要組成部分。每分子細(xì)胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈?，F(xiàn)已從許多來源獲得細(xì)胞色素C結(jié)晶，并已對100多種細(xì)胞色素C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進行了測定。結(jié)果表明，細(xì)胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間；不同來源細(xì)胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細(xì)胞色素C中賴氨酸含量較高，等電點為10.7，含鐵量為0.38%~0.43%，Mr為12000~13000，豬心細(xì)胞色素C分子量12200。細(xì)胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細(xì)胞色素C對熱比較穩(wěn)定，不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘，細(xì)胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%，若增加加熱時間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細(xì)胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細(xì)胞色素C制成還原型的，因為比較穩(wěn)定并易于保存。

    三、試劑與儀器

    絞肉機、電磁攪拌器、離心機、分光光度計、玻璃柱、下口瓶、燒杯等。

    四、操作方法

    材料處理—提取—中和—吸附—洗脫—鹽析—沉淀—透析—測定

    五、關(guān)鍵步驟與注意事項

    ① 吸附前必須把人造沸石處理好,裝柱時避免柱內(nèi)出現(xiàn)氣泡,沿柱壁緩緩流入柱內(nèi)。

    ② 洗脫時洗脫液一旦變白，立刻停止收集。洗脫完畢人造沸石可再生使用。